T4 DNA Ligase(1-5U/μl)
10×Buffer* [LGA-1B]
*不含rATP。可使用rATP[Code No.ATP-111]。
 

组成:
20mM Tris-HCl (pH7.6)
1mM EDTA
60mM KCl
5mM DTT
50% Glycerol
10×Buffer [Code No. LGA-1B] 组成:
  660mM Tris-HCl (pH7.6)
  100mM DTT
    66mM MgCl₂

活性的定义:

在ATP-PPi交换反应中，在37℃、pH值7.6下，在20分钟内交接1nmole的³²PPi时所需要的酶量为1U。
本酶1U(Weiss Unit)相当于125 Ligation Unit。

来源:
E.coli 重组体

纯度:
10U的本酶和1μg的λDNA/HindⅢ分解物在16℃下反应20小时，DNA的电泳模式未见变化。
10U的本酶和1μg的super coiled φx174 DNA 在16℃下反应20小时，DNA的电泳模式未见变化。
活性测定条件下，本酶与1μg的E.coli [³H]-DNA的反应中，游离为酸可溶性组分时的放射能活性为0.01%/小时/U以下。
活性测定条件下，本酶与1μg的5’端标记的³²P的λDNA/HindⅢ分解物反应，游离为可溶性组分的放射能活性为0.01%/小时/U以下。
 

<与载体的连接反应>
灭菌蒸留水 Xμl
载体DNA 0.05-0.5μg
插入DNA   3倍于载体的mole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 0.5-1U(突出末端)
1-5U(平滑末端)
Total Volume 20μl

16℃、4-16hr.

<linker连接反应>
灭菌蒸留水 Xμl
DNA 0.1-1μg
linker   10倍于DNA mole数
10×Buffer 2μl
rATP 1mM
T4 DNA Ligase 1-5U
Total Volume 20μl

16℃、8-16hr.

*DNA的浓度、形状、碱基序列及长度不同，效率也发生变化。

●平滑末端的连接
平滑末端的连接与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端酶量的2～5倍左右。

●反应温度
本酶最适温度为37℃，考虑到连接DNA的末端的杂交效率，通常在16℃进行反应。有时也可在4℃～室温下进行反应。

●EDTA
本酶要求有Mg²⁺存在，因此螯合Mg²⁺的EDTA对反应有抑制作用。用含有高浓度EDTA的缓冲液溶解DNA作为样品使用时，推荐用灭菌蒸馏水或TE缓冲液替换后再使用。

●DNA量
质粒DNA与插入DNA的反应，其摩尔比应调整为1:3。与粘粒或噬菌体进行连接反应时，可使载体和插入片段的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果(0.05～0.1μg/μl以上)。