通过强3'→5'Exonuclease活性进行DNA的平滑化及3'末端标记。

大肠杆菌来源的DNA合成酶 T4 DNA Polymerase

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TPL-101 100U×1支 RMB240 -20℃ -

用途

●双链DNA末端的平滑化

●用引物延伸法进行mRNA转录起始点的分析
●DNA片段3'末端的标记

说明

 dNTPs存在条件下,使用本酶对具有3’末端突出的双链DNA进行作用时,达到平滑状态时,Exonuclease活性与Polymerase活性呈竞争状态。另一方面,dNTPs不存在时,会进行Exonuclease活性引起的DNA分解反应。


 

原理

参考文献

1)A. Panet et al., Biochemistry, 12: 5045-5050(1973)
2)M. Goulian et al., J. Biol. Chem., 243: 627-638(1968)
3)I. R. Lehman, Methods in Enzymology, 29: 46-53(1974)
4)F. Sanger and A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94: 441(1975)
5)J. Sambrook et al., Molecular Cloning(A LaborartoryManual),108, Cold Spring Harbor Laboratory
6)R. M. Warlet and W. S.Reznikoff, Gene, 9: 307-319(1980)
7)N. Davidson et al., Gene, 42: 21-29(1986)

产品内容

T4 DNA Polymerase

10×Buffer


组成:

200mM KPO4 (pH7.0)

2mM DTT

50% Glycerol


10×Buffer组成:

  500mM Tris-HCl (pH8.5)

  70mM MgCl2 

  150mM (NH4 )2 SO4 

  5mM DTT

  1mM EDTA


活性的定义:

以用Mung Bean Nuclease部分消化的热变性的小牛胸腺DNA为模板/引物,在37℃下,在30分钟内将10nmoles的全核苷酸摄入为酸不溶性成分所需的酶量为1U。


来源:

E.coli B infected with T4 phage


纯度:

10U的本酶和1μg的超螺旋φx174 DNA在37℃下反应5小时,DNA的电泳模式未见变化。

基本反应条件 

<5'末端的平滑化>

底物DNA 0.5~2μg

10×Buffer 2.5μl

2mM dNTPs 0.5μl

T4 DNA Polymerase 2U

Total Volume 25μl  


37℃,  2hr.


底物DNA 0.2~0.5μg

10×Buffer 2μl

T4 DNA Polymerase 1U

Total Volume 20μl 


37℃、Xmin.

反应时间,根据要去除的长度设定。按30~80base/min.的标准设定。

 ↓

add: 含标签的2mM dNTPs 1μl  


37℃,  1hr.

注意事项

●DNA合成反应

本酶因易受DNA高级结构的影响,推荐在通常的DNA延伸反应中使用Klenow Fragment。


●双链DNA末端的平滑化

用本酶进行双链DNA末端的平滑化时,即使利用3'→5'Exonuclease 活性进行平滑化,也请在反应液中加入dNTPs(终浓度40~100μM)。


●最适pH

本酶的最适pH为8~9,pH7.5及pH9.7时活性约为前者的1/2。大量使用pH8~9范围以外的缓冲液中溶解的DNA样品时,推荐用乙醇沉淀或纯化试剂盒(请参考相关产品)等进行缓冲液的替换。

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