KOD FX
实验例34: 对福尔马林固定石蜡包埋切片提取的DNA的分析





实验例18:福尔马林固定石蜡包埋切片抽提DNA的分析






M: 100bp DNA Ladder
1: Proteinase K处理后、过柱纯化得到的DNA
2: Proteinase K处理后、经70℃10分钟处理的粗样品 
3: DW
< 加样量:2μl / Lane>



【样品】
福尔马林固定石蜡包埋材料(人)
(本次使用的切片厚度约为10μm、大小约为1cm x 2cm



【前处理】
5~10μm石蜡包埋切片放入1.5ml离心管

脱石蜡
加入二甲苯、静置5分钟后离心去除二甲苯
(重复3次)

脱二甲苯
加入100%乙醇、静置5分钟后去除乙醇

(重复4)

去除乙醇后、70℃・5分钟完全除去乙醇

加入10mM Tris-HCl (pH 8.0) 300μl后、加Proteinase K(10mg/ml) 10μl37放置一晚



在本实验中,添加了10mM Tris-HCl (pH 8.0) 300μl,根据样品量可在50〜300μl范围内使用。Proteinase K的量也请根据样品量作相应的增减。
切片较大的情况下,添加buffer 后,用眼科用的镊子把切片分割成1mm以下后再添加Proteinase K
※37℃放置一晚后,未消化的组织仍较多的情况下,再添加5〜10μl 的Proteinase K,消化2〜3小时。
根据组织的细胞密度、种类等的不同,消化的情况也不一样。由于纤维组织无法被Proteinase K消化,因此含肌肉、膜等较多的组织不能完全溶解。



加热处理(70℃10 min)  直接作为PCR用样品使用

过柱纯化(使用硅石膜片的离心柱纯化)  作为DNA模板使用



目的片段
Human β-globin 268bp



引物
Primer F:GAAGAGCCAAGGGCAGGTAC
Primer R:CAACTTCATCCACGTTCACC



参考文献:Am.J.Pathol. 154;67-75,1999




反应液组成

 灭菌蒸馏水

   3.6 (μl)

 2×PCR buffer for KOD FX

   10

 2mM dNTPs

    4

 10pmol / μl Primer F 

    0.5

 10pmol / μl Primer R  

    0.5

 KOD FX (1.0U /μl) 

    0.4

 纯化DNA or Lysate

    1 *

 Total 

  20 (μl)



*Proteinase K处理后的Lysate 1μl为基准添加。
纯化DNA的添加量以20μl反应体系约100ng为基准。由于组织量较少时,回收量也会变少,因此,要保证过柱纯化溶出的DNA能满足最低量,适量添加。添加量超过1μl时,要调整灭菌蒸馏水量。



PCR 循环



94℃ 15 min**

(98℃ 10 sec, 57℃ 30sec, 68℃ 30sec)×38cycles



**福尔马林固定组织得到的DNA扩增,预变性步骤设定为7~15分分钟可得到良好的结果。



【数据提供】
福冈大学 医学部 病理学教研室
石黑 晶子 老师、竹下 盛重 老师、福重 智子 老师





【来自老师的评语】
用其他公司的聚合酶,即便使用纯化后的DNA,仍有很多样品无法扩增。而用KOD FX,无论是经纯化的DNA还是Proteinase K处理后的石蜡包埋材料的Lysate,均可得到高效率的PCR产物。组织较小时,如果再对其进行纯化,则DNA量会变少,因此不要纯化直接PCR较好