数据提供: 广岛大学医齿药保健学研究科 产科妇科教研室 助教 杉本 润

<实验目的>
 在哺乳动物细胞用表达载体中对重组基因A进行了氨基酸替换的3个碱基突变。

<实验方法>

【样品】
 质粒:哺乳动物细胞用表达载体(约7.1kb)：重组基因A(约1.8kb)的质粒

【样品的制备方法】
 用Qiagen midi kit抽提、纯化的质粒DNA

【基因名称与目的片段长度】
 基因A : 1.8kb,  Vector: 7.1kb

【引物】
 突变导入用引物Forward (31 base)
 突变导入用引物Reverse (31 base)

【反应液组分】                                        【PCR循环】
                     
灭菌蒸馏水             X                              98℃  10sec.  
KOD One PCR Master Mix 12.5 μl                  55℃  15sec. 30cycles
引物Forward            0.2μM                      72℃  40sec.  
引物Reverse            0.2μM    
Template               50pg    
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Total 25  

【检测仪器】

  GeneAmp PCR system 9700

<结果・讨论>

  <感受・建议等>

迄今为止，本研究室使用的哺乳动物细胞用表达载体中，在重组基因序列中进行突变导入时非常困难。由此，在不同载体(pGEM-T等)中的重组基因中导入突变后，切出包含突变的DNA片断，需要再对哺乳动物细胞用表达载体进行克隆。但是，通过使用KOD One，能够直接导入突变，从而缩短了时间、人力。另外，突变的导入效率在测试的几个克隆中是100％，并确认在突变位点附近序列中没有PCR错配。