<实验目的>
可确认无需从丝状菌・酵母的菌体抽提、纯化即可进行DNA的扩增。

<实验方法>
【样品的种类】
Aspergillus oryzae 及 Saccharomyces cerevisiae 菌体

【样品的制备方法】
用牙签从丝状菌・酵母生物的培养板挑菌，以以下制备物为模板。
1. 50μl的灭菌水悬浊液中取 5μl
2. 20μl的灭菌水悬浊液中取 5μl
3. 直接PCR 

【基因名称与目的片段长度】
18S rRNA的 ITS1区域
Aspergillus oryzae : 约180bp
Saccharomyces cerevisiae : 约450bp

【引物序列】
ITS1 Forward Primer : GTAACAAGGTYTCCGT
ITS1 Reverse Primer : CGTTCTTCATCGATG
※目的片段比较短，所以本实验中使用的引物比推荐长度(22～35mer)更短的引物。

【反应液组分】                              【PCR循环】
  (μl)  
  灭菌蒸馏水              3.8 或 8.8            98℃  10sec.  
  KOD OneTM PCR Master Mix 10            45℃    5sec. 30cycles
  10μM Forward Primer 0.6               68℃  10sec.  
  10μM Reverse Primer 0.6    
  Template              5 或菌体    
  --------------  
  Total 20  

<点评>
使用Saccharomyces cerevisiae时，样品制备方法不同，虽然未能看到扩增量的差别，但在使用Aspergillus oryzae 时，直接将悬浊菌液加入到PCR反应液中时扩增很好。另外，分别用KOD OneTM PCR Master Mix和KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-扩增时，结果没有差别。


※对菌体的直接PCR，虽然菌体量过多时会产生抑制作用，导致不能扩增，但另一方面，霉菌等细胞因为比较坚固，如果不加入足够的量，则有可能也不能扩增。所以推荐事先进行一下菌体添加量的优化。

进行菌体量优化也不能扩增时，可将延伸时间设定为10sec./kb，可能会扩增。

另外，使用KOD OneTM PCR Master Mix 时，推荐的PCR循环中不包括预变性这一步，所以进行样品制备时，用灭菌水悬浊后，进行95℃, 5min.左右的热处理，不同菌种，有时PCR效率也不同。