数据提供 :  冈山大学 大学院医齿药学综合研究科 细胞组织学专业  佐藤 恵太 

<实验目的>
分离鸡的 cDNA序列。

<实验方法>
【样品的种类】
用鸡E17胚眼组织制备单链 cDNA

【样品的制备方法】
使用Nippon gene的ISOGEN II从鸡E17胚 眼组织中提取total RNA，
使用Thermo Fisher Scientific SuperScript III First-Strand Synthesis System及oligo dT引物合成单链cDNA。

【目的片段基因長、引物Tm値】
  鸡的基因A 鸡的基因B
  目的片段长度   大约1,500 bp   大约2,000 bp 
  Forward Primer长度, Tm   长度: 20  Tm: 76.2 ℃   长度: 27  Tm: 68.0 ℃
  Reverse Primer长度, Tm   长度 :27  Tm: 68.1 ℃   长度 :23  Tm: 69.4 ℃

■KOD One® PCR Master Mix
【反应液的组成】                                                       【PCR循环】 
                                             (μL)  
  KOD One^® PCR Master Mix    2.5                               98℃  1min.  
  2μM Primer F                        1                                 98℃  10sec. 35cycles
  2μM Primer R                        1                                 60℃   5sec.
  Template  (浓度未测定)        0.5                               68℃  15sec.
   --------------------------------
  Total Volume 5.0  

■A公司高速·高保真PCR Master Mix
【反应液的组成】                                                       【PCR循环】 
  (μL)  
  A公司高速・高保真 PCR Master Mix    2.5                    98℃  1min.  
  2μM Primer F                                   1                      98℃  10sec. 35cycles
  2μM Primer R                                  1                      60℃   5sec.
  Template  (浓度未测定)                   0.5                     72℃  15sec.
   -------------------------
  Total Volume 5.0  

【循环仪机型】
Biometra TGradient
ATTO AE-6932GXES print graph


<结果・讨论>
用1% Agarose/TAE进行电泳，从左开始依次为：1kb ladder (SMOBIO DM3100)、
基因A(KOD One)、基因A(A公司高速・高保真PCR Master Mix)、基因B(KOD One)、基因B(A公司高速・高保真PCR Master Mix)。
将各样品与SMOBIO FluoroDye混合后进行电泳，在兰色LED
灯下观察拍照。
虽然基因A中出现了较多非特异的扩增条带，但是可以确认在目的片段长度处有明亮的扩增条带。KOD One、A公司的高速・高保真PCR Master Mix都可以同等效率地扩增目的条带，可以认为两者具有相同的扩增效率与特异性。