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| [2010/03/24] |
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THUNDERBIRD qPCR Mix Q&A |
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THUNDERBIRD qPCR Mix系列产品（货号以QPS开头，以下简称新产品）上市已经半年多时间了，凭借其优异的性能表现，赢得了很多新用户的认可；然而，部分之前使用过我公司Realtime PCR Master Mix系列原产品（货号以QPK开头，以下简称原产品）的用户，却在试用新产品的过程中遇到了一些问题，我公司经过收集整理，对以下几个具有代表性的问题进行详细解答，供广大用户参考：
| Q1: 为什么在相同循环条件下，对比原产品，新产品的荧光值偏低？ |
| A1: |
由于过多的SYBR Green Ⅰ染料会抑制PCR反应，因此为了提高PCR反应效率，增加反应的特异性及灵敏度，从而得到更广的可定量扩增区域，在新产品中SYBR Green Ⅰ染料的含量少于原产品，因此未经参比荧光校正的新产品荧光值会低于原产品，但使用参比荧光校正后，荧光值便不会低。另外，荧光值的降低也不会影响反应结果，新产品足够用于检测目的基因的表达水平。
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| Q2: 为什么在相同循环条件下，使用新产品的实验结果不如原产品？ |
| A2: |
对比原产品，新产品融解曲线的Tm值降低。由于新产品与原产品buffer组分的含量不同，因此在使用两种产品的反应体系中，离子强度也不同，进而导致融解曲线的Tm值不同（使用不同公司试剂的Tm值不一定一致）。新产品融解曲线的Tm值低于原产品，是因为通过降低Tm值可使模板DNA变性更加容易，从而提高扩增效率。
融解曲线Tm值的不同，在相同的循环条件下，实验结果也会不同。建议用户在使用新产品时要重新摸索反应条件，通常来讲使用新产品时的退火温度相比原产品要降低2℃左右。
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| Q3: 为什么在相同循环条件下，新产品的重复性和稳定性不如原产品? |
| A3: |
① 使用三步法循环时的退火温度或使用两步法循环时的退火/延伸温度接近Tm值时PCR会不稳定。
② 新产品的Tm值比原产品低，因此在PCR循环条件中，退火温度新产品应低于原产品。而一些习惯使用原产品的用户把原产品的最佳循环条件用于新产品上，由于并不是新产品的最佳循环条件，所以一些习惯使用原产品的用户会感觉新产品的重复性和稳定性不如原产品。建议用户使用新产品时要重新摸索反应条件，通常来讲退火温度相比原产品要降低2℃左右。
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| Q4: 为什么使用新产品有时会出现荧光值紊乱现象？ |
| A4: |
① SYBR GreenⅠ的荧光淬灭:为防止SYBR GreenⅠ的荧光淬灭，请务必避光保存（请使用避光箱或产品内配有的铝箔袋）。
② 新产品中ROX需另外添加，一些习惯使用原产品的用户在使用时不习惯，可能会出现一些误操作，建议用户使用时请按照说明书中ROX的添加说明操作。
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| ※ |
与SYBR Green Ⅰ染料相关的因素仅供使用SYBR Green掺入法试剂盒时参考，其余因素同时适用于SYBR Green掺入法和TaqMan探针法两种试剂盒；
原产品中参比荧光染料(Passive Reference)ROX预混在Master Mix中（终浓度为1×）；新产品中参比荧光染料ROX未预混（单独一管），用户可根据所用仪器的不同，在反应体系中添加特定终浓度的参比荧光染料或不添加该染料，因而特别适用于某些要求ROX终浓度在0.1×的高速qPCR仪。 |
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 THUNDERBIRD qPCR Mix Q&A
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