可简便地在短时间内从培养细胞开始制备荧光定量PCR用的模板cDNA
Realtime PCR用细胞溶解&cDNA合成试剂盒（用于培养的细胞） SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR
价格表
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| SCQ-101 | 100次份 | RMB 4,800 | -20℃ |
|
| SCQ-101S | 20次份 | RMB 1,000 | -20℃ |
|
SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| SCQ-201 | 100次份 | RMB 2,400 | -20℃ |
|
| SCQ-201S | 20次份 | RMB 500 | -20℃ |
|
用途
Realtime PCR cDNA的合成
说明
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)是通过荧光定量PCR进行基因表达分析用的、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。使用本产品，可以从用96孔板等培养的细胞开始，简便地制备含有能用作逆转录模板的RNA的细胞裂解物。而且，本试剂盒中含有的逆转录反应试剂，针对于从该细胞裂解物开始的逆转录反应进行了优化。使用本试剂盒，可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量PCR用的模板cDNA，可用于高通量分析。
SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)是单独销售的细胞裂解试剂（Lysis Reagents）。可以使用本公司的RNA-directTM Realtime PCR Master Mix(Code No. QRT-101, QRT-201)等1-step法Realtime PCR试剂进行分析（简易测定）。
特征
●无需纯化RNA
细胞用PBS(-)洗净后，向细胞中添加Lysis Solution (添加gDNA Remover)，悬浊，室温温育5分钟，即可同时进行细胞裂解和基因组DNA的分解。反应停止只要添加Stop Solution处理即可，无需热处理。
逆转录反应时，添加细胞裂解物（不要稀释），温育25分钟。
●从裂解物开始合成高品质的cDNA
通过优化的buffer组成，有效地抑制了因RNase等的细胞成分引起的RNA的降解，将cDNA合成中夹杂成分的影响降至最低（制备的RNA可在冰上稳定保持2小时）。另外，因为用DNase I处理后再进行cDNA的合成，所以可以合成基因组DNA污染少的高质量的cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」进一步优化后的Master Mix，可简便、高效率地合成cDNA。合成的cDNA可长期保存。
本试剂可用于多种类型的细胞的分析。已经确认下表中的代表性细胞可适用于本品。
*Master Mix中Random 引物和Oligo dT引物按最适比例进行了混合。
|
|
细胞名称 |
贴壁／悬浮 |
种类 |
细胞 |
来源 |
|
1 |
A431 |
贴壁 |
H.sapiens |
epidermoid carcinoma cell line |
上皮样细胞癌 |
|
2 |
C2C12 |
贴壁 |
M. musculus |
myoblast cell line |
肌细胞 |
|
3 |
Caco-2 |
贴壁 |
H.sapiens |
colon adenocarcinoma cell line |
大肠癌 |
|
4 |
CHO-K1 |
贴壁 |
C. griseus |
ovary cell line |
卵巢 |
|
5 |
COLO205 |
悬浮 |
H.sapiens |
colon adenocarcinoma cell line |
大肠癌 |
|
6 |
DLD-1 |
贴壁 |
H.sapiens |
colon adenocarcinoma cell line |
大肠癌 |
|
7 |
HCT-15 |
贴壁 |
H.sapiens |
colon adenocarcinoma cell line |
大肠癌 |
|
8 |
HDF |
贴壁 |
H.sapiens |
primary foreskin fibroblasts (primary cell) |
皮肤纤维芽细胞 |
|
9 |
HEK293 |
贴壁 |
H.sapiens |
embryonic kidney cell line |
胎儿肾 |
|
10 |
HeLa S3 |
贴壁 |
H.sapiens |
cervix carcinoma cell line |
子宫颈癌 |
|
11 |
HepG2 |
贴壁 |
H.sapiens |
hepatocellular carcinoma cell line |
肝癌 |
|
|
|
|
|
|
|
|
12 |
Jurkat |
悬浮 |
H.sapiens |
T lymphocyte cell line |
白血病T细胞 |
|
13 |
K562 |
悬浮 |
H.sapiens |
myelogenous leukemia cell line |
成红细胞样白血病细胞 |
|
14 |
KUSA-A1 |
贴壁 |
M. musculus |
bone marrow stromal stem cell line |
成骨细胞样细胞系 |
|
15 |
L929 |
贴壁 |
M. musculus |
aneuploid fibrosarcoma cell line |
结缔组织 |
|
16 |
MCF7 |
贴壁 |
H.sapiens |
breast adenocarcinoma cell line |
乳腺癌 |
|
17 |
Neuro2a |
贴壁 |
M. musculus |
neuroblastoma cell line |
神经细胞瘤 |
|
18 |
NIH-3T3 |
贴壁 |
M. musculus |
embryo fibroblast cell line |
胎仔纤维芽细胞 |
|
19 |
PC12 |
贴壁 |
R. norvegicus |
adrenal pheochromocytoma cell line |
肾上腺褐色细胞瘤 |
|
20 |
rMSC |
贴壁 |
R. norvegicus |
bone marrow stromal stem cells (primary cell) |
骨髓间质细胞 |
|
21 |
THP-1 |
悬浮 |
H.sapiens |
acute monocytic leukemia cell line |
单核细胞 |
|
22 |
U937 |
悬浮 |
H.sapiens |
leukemic monocyte lymphoma cell line |
单核细胞 |
●降低了高通量分析时的误差
按照本操作步骤，移液分管及稀释操作步骤减少，降低了高通量分析时的误差。另外，细胞裂解时无需用移液枪头上下吹打混匀，而且同时可进行DNase I处理，提高了操作性。只要加入Stop Solution就可以终止DNase I的反应，无需引起RNA不稳定的加热操作。
●可以与各种荧光定量PCR试剂组合使用
可以与各种各样的荧光定量PCR试剂（SYBR® Green I, TaqMan® assay两种都可以）组合使用。
另外，与本公司的THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)等组合使用，已确认可以从培养细胞开始简便且高度准确的进行基因表达分析。而且，与本公司的RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的1-step荧光定量PCR试剂组合使用， 可进行简易的分析。
实验例
1. 纯化RNA与细胞裂解物的Ct值相关性的检验
使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR，从2.5×104个HEK293细胞开始合成cDNA(40ul反应体系)。另外，从HEK293细胞抽提的Total RNA 66.6ng开始，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201),进行cDNA的合成（40ul反应体系）。
之后，以分别的cDNA为模板，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR (Code No. QPS-201),对15种管家基因进行荧光定量PCR，检验得到的Ct值的相关性。
结果表明，这次分析的15种基因，纯化RNA与使用细胞裂解物分析得到的结果具有良好的相关性。
2. 将数据的误差考虑在内的分析体系的质量评价
将HeLa S3细胞铺板于96孔板中，每孔加2×104个细胞，加100mM的PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）培养24小时。之后，用PBS(-)洗涤PMA处理过的12个孔、未处理的12个孔，用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR处理后进行cDNA的合成。以得到的cDNA为模板，使用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101),对IL-6、IL-1β、β-actin基因进行TaqMan探针分析（n=12进行实验）。同样，使用A公司的对等产品进行荧光定量PCR（逆转录与荧光定量PCR试剂也是A公司试剂盒里附带的产品）。IL-6、IL-1β基因的Ct值用β-actin基因进行校正（△Ct）, 计算PMA处理前后的差（△△Ct）。
接着计算出Z’-factor并进行比较。
结果显示，两者的Z’-factor均超过了作为分析体系质量标准的0.5，但是使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR、THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101)的实验中，与A公司的对等产品相比，显示出更高的Z’-factor，可见这是一种误差更少的良好的分析体系。
3. 对RNase活性强的细胞分析效率的验证
单细胞来源的细胞株U937的RNase活性相对较高，使用细胞裂解液分析困难。
本实验中，用分别从1×104，,1×103,1×102,1×10个U937细胞制备的细胞裂解物8ul，进行cDNA的合成（40ul反应体系），反应后，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Code No. QPS-201),对β-actin基因进行荧光定量PCR。
同样，使用A公司的同类品进行同样的分析（逆转录与荧光定量PCR试剂也是使用A公司试剂盒附带的产品）。
另外，使用从同样的样品纯化的相当量的Total RNA进行分析（使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201],THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix [Code No. QPS-201]）。
结果显示，只有用本公司的产品分析，才能得到与使用纯化的RNA时相同的很高的线性相关性。
4.悬浮细胞的96孔板分析及基因表达分析的实验例
详细信息请参考这里（UPLOAD VOL. 102的链接）用pdf文件打开。
- 产品内容
【SCQ-101】
(Lysis Reagents)
・Lysis Solution 5.5ml
・Stop Solution 1100μl
・gDNA Remover 33μl
・RNase Inhibitor 55μl
(RT Reagents)
5 x RT Master Mix 860μl
5 x RT Master Mix no-RT
control 86μl
Nuclease free Water 1000μl×3
【SCQ-201】
Lysis Solution 5.5ml
Stop Solution 1100μl
gDNA Remover 33μl
RNase Inhibitor 55μl
- 基本反应条件
用PBS(-)洗涤细胞
↓
按以下比例(1个反应)向Lysis Solution中添加gDNA Remover
Lysis Solution 49.7μl
gDNA Remover 0.3μl
↓
向有细胞的各孔中添加Lysis Solution (含有gDNA Remover)50μl
↓
振荡30秒后，放室温孵育4分钟30秒
↓
按以下比例(1个反应)向Stop Solution中添加RNase Inhibitor
Stop Solution 9.5μl
RNase Inhibitor 0.5μl
↓
向各孔中添加Stop Solution(含有RNase Inhibitor)10μl
↓
振荡30秒后，室温孵育1分钟30秒
↓
置于冰上
<逆转录(RT)反应>
按以下比例(1个反应)在冰上制备RT Master Mix。
5x RT Master Mix 8μl
Nuclease-free Water 24μl
↓
每孔分装32μl
↓
添加裂解液8μl
↓
37℃, 15min.
50℃, 5min.
98℃, 5min.(使酶失活)
4℃, Hold.
- 几点建议
●一次能够处理的细胞数量
细胞数过多，有可能不能充分裂解，会引起对RT-PCR的抑制、基因组DNA不能完全降解。本试剂一般能够处理10~7×104个细胞的细胞样品，但因细胞种类不同，多少会不同。推荐以104个细胞为标准，通过预实验确认细胞数量的上限。
●含有RNA的裂解物的稳定性
细胞种类不同，有可能RNase的活性较强、处理后仍然残存有RNase活性，所以推荐立刻进行逆转录（RT）反应，转化为cDNA。实验暂时中断时，将样品移至冰上等待。等待时间请以2小时为标准。
FAQ请点击这里
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