对M-MLV RTase进行了改良 提高了延伸性・反应效率・高温反应性。

高效率逆转录酶 ReverTra Ace®

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价格表

Code No. 包装 价格 保存温度 说明书
TRT-101 10,000U×1支 RMB 800 -20℃ -

用途

1cDNA合成

说明

RNaseH活性在cDNA合成中,会分解作为模板/引物的DNA-RNA杂交体中的RNA,导致反
应效率下降。而本酶可降低该RNaseH活性。ReverTra Ace®通过在M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase基因的RNaseH活性结构域导入点突变,降低了该活性
另外,RNA的高级结构会阻碍RTase反应的进行,使得cDNA合成困难本酶通过在DNA合成结构域导入点突变,提高了反应效率及高温反应性能,所以可在高温下进行反应因此,可通过提高反应温度来缓和模板RNA的高级结构,可促进RTase对cDNA的合成反应。

另外,本酶比原有的deletionM-MLV RTase RNaseH−相比,高出其4倍的活,可高效率地进行cDNA合成。


 

特征

●提高了延伸性
去除了M-MLV RTaseRNaseH活性,延伸性有了明显的提高


●提高了反应效率・高温反应性
通过在M-MLV RTaseDNA合成区域中导入点突变及改良反应组分,提高了高温反应性和反应效率。


●最适合于RT-PCR
可在各种条件下进行逆转录反应特别适用于RT-PCR

 

原理

实验例

1.  4260时的cDNA合成反应
以带有poly(rA) Tail,长度分别为9.497.464.402.371.35kbRNA 0.4μg为模板,以oligo(dT)20 25pmoles为引物,在42〜60℃的反应条件下,用本酶100U,进行30min.cDNA合成反应。

结果显示,用ReverTra Ace,在4250℃时生成了9.49kb55生成了4.4kb60生成了2.37kbcDNA合成产物。



2.  cDNA合成效率的比较
以在in vitro条件下合成的G3PDHRNA 102〜105copies为模板,使用G3PDH的下游引物,4220min.进行cDNA合成反应后,加入G3PDH上游引物,用rTaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201)进行PCR反应。
结果可见,用ReverTra Ace,即便是以102copiesRNA为模板合成的cDNA为模板,也可确认到扩增产物。




3.  14kbcDNA合成反应
Human骨骼肌poly(A) RNA为模板,使用dystrophin mRNA3'端的特异性cDNA合成用引物,4230min.进行cDNA合成反应后,使用mRNA5'端特异性PCR引物对(位于cDNA合成引物上游14kb处),用KOD Dash(Code No.LDP-101) 进行PCR,判断有无延伸。
结果可见,使用ReverTra Ace,可合成14kb以上cDNA






 

参考文献

1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)
商品使用文献
1)T. Ikeda et al., Endocrinology 142(4): 1419-1426.(2001)
2)S. Ohuchi et al., Nucleic AcidsResearch, 30(15): 3473-3480.(2002)
3)K. Minami et al., ToxicologicalSciences 87(1): 296-305.(2005)

产品内容

ReverTra Ace®(100U/μl)   100μl

5×Buffer* (TRT-1B)    1ml



*5×Buffer中不含有dNTPs。



组分:

50mM          Tris-HCl (pH7.5)

100mM         NaCl

0.1mM          EDTA

10mM           DTT

0.01%           Nonidet® P-40

50%              Glycerol



活性的定义:

以Poly(rA):Oligo(dT)20为模板/引物,在42℃下,10分钟内摄入1nmole的dTTP使成为酸不溶性沉淀物时所需的酶量为1U。



纯度:

50U的本酶和0.2μg的MS2 RNA在42℃下反应1小时,RNA电流模式未见变化。



来源:

E.coli 重组体

基本反应条件

灭菌蒸馏水        Xμl

模板RNA

  total RNA       100-1000ng

  poly(A)+ RNA    50-500ng

Primer

  oligo(dT)       5pmoles

  random          25pmoles

  gene specific   5pmoles

5×Buffer         4μl

10mM dNTPs        2μl(1mM)

ReverTra Ace®(100U/μl)  1μl(100U)

RNase Inhibitor   1μl

Total Volume      20μl



30℃, 10min*

42℃, 20-60min.

99℃, 5min.



*该步骤只在使用Random Primer时需要。



<1st strand DNA合成>

灭菌蒸馏水Xμl

poly(A)+ RNA 0.4μg

oligo(dT) 25pmoles

5×Buffer 4μl

10mM dNTPs 2μl(1mM)

ReverTra Ace®(100U/μl)  1μl(100U)

RNase Inhibitor 20U

Total Volume 20μl



42℃, 30min.

99℃, 5min.

几点建议

●反应温度

本酶通常在42℃下进行反应。为了缓和RNA的高级结构而提高反应温度时,须注意引物的退火效率。使用Random引物时,请先在25~30℃下温育10分钟后再开始反应。



●mRNA的热变性

为了缓和RNA的高级结构,先对mRNA进行热变性再进行反应会提高效率。此时请在热变性处理后再添加本酶。

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