数据提供 : 札幌医科大学 医学部 分子生物学讲座  新沼 猛 

<实验目的>
基因克隆目的的PCR

< 实验方法>
【样品的种类】
HUVEC cDNA

【样品的制备方法】
使用从培养的细胞抽提的RNA 500ng，用ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)进行cDNA的合成。

【目的片段长度】
大约2,200 bp

【引物】
Forward Primer :　长度 :  30 mer        Tm: 84 ℃
Reverse Primer :　长度 :  29 mer        Tm: 72 ℃

■KOD One® PCR Master Mix
【反应液的组成】                                                           【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                                9.75                        98℃  10sec.   35cycles
  KOD One® PCR Master Mix          12.5                        60℃   5sec.
  10μM Forward + Reverse Primer   0.75                       68℃  20sec.
  Template (HUVEC cDNA)              2    
   
  Total Volume 25  
■A公司 高效率PCR 酶
【反应液的组成】                                                           【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                                17.65                       98℃  10sec.   35cycles
  10×PCR Buffer                           2.5                          60℃  30sec.
  2.5mM dNTPs                             2                           72℃ 120sec.
  10μM Forward + Reverse Primer   0.75    
  PCR 酶                                       0.1  
  Template (HUVEC cDNA)              2  
   -----------------------------
  Total Volume 25  

■A公司高速·高保真 PCR Master Mix
【反应液的组成】                                                           【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                                 9.75                         98℃  10sec.   35cycles
  PCR Master Mix                           12.5                         60℃   5sec.
  10μM Forward + Reverse Primer   0.75                        72℃  20sec.
  Template (HUVEC cDNA)              2    
   ----------------------
  Total Volume     25  

< 结果·讨论> 
 
这次的PCR结果使用KOD One扩增出了基因的全长。以前用A公司的高效率PCR酶没有得到扩增，使用KOD One得到了扩增。这次，在A公司的高效率PCR酶中添加了A公司的高速・高保真 PCR Master Mix再次进行了比较，但是仍然未得到A公司高效率PCR酶、高速・高保真PCR Master Mix的扩增结果。
虽然没有提供这些数据，但是也进行了cDNA合成等几种PCR，对这些区域的扩增效率均与A公司高速・高保真 PCR Master Mix相同或更高。

<感受及建议等>
原来一直喜欢用A公司的高速・高保真 PCR Master Mix，但是现在可以用KOD One进行替换，替换后可以非常顺利地进行实验。